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蛋白免疫印迹实验新上映_免疫印迹一般用于什么(2024年11月抢先看)

内容来源：冲顶技术团队所属栏目：导读更新日期：2024-11-26

蛋白免疫印迹实验

nc膜转膜蛋白免疫印迹（Western Blotting）是一种用于检测特定蛋白质的技术，通过将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体进行检测。以下是转膜过程中的一些注意事项：选择合适的膜：建议使用PVDF膜，因为它的蛋白结合效率比NC膜高，大约在155-300 ug/cmⲯ𜌨€ŒNC膜的效率约为80-100 ug/cmⲣ€‚ 转膜前的准备：转膜时需要准备两个盘子，一个大盘子倒入转膜液，另一个小盘子倒入适量的甲醇。将胶从玻璃板上剥下来，切掉积层胶部分后浸泡在转膜液中。与胶相同大小的滤纸也浸泡在转膜液中，浸透。激活PVDF膜：切好的PVDF膜不要急着泡到甲醇中，而是应该让它轻轻漂在甲醇液面上10秒，甲醇足够激活PVDF膜。激活后不能让膜干掉，可以先做三明治，等到要加膜时再将膜丢进甲醇激活。制作三明治：制作三明治时需要使用玻璃滚棒或干净的玻璃试管，将膜和胶之间的气泡碾掉。湿转条件：湿转条件一般设置为200mA恒流，2.5-3小时。时间较长，需要控制发热，最好准备一个大冰盒装满碎冰，加点水，把转膜槽埋在冰水混合物里降温。讲究一点的话，可以在转膜槽里加一颗磁力转子，把冰盒和转膜槽整个放在磁力搅拌器上，一边搅拌一边转。或者把转膜槽塞到4度冰柜里。半干转条件：半干转的三明治要保持湿润，但三明治周围的金属板要保持干燥。半干转的条件是用恒压20V，20分钟到1小时。如果蛋白大可以延长转膜时间。选择合适的转膜液：湿转能转的蛋白大小范围非常宽，普通的半干转适合转30-120KD大小的蛋白。有些特殊设计的半干转与湿转一样，可以转任意大小的蛋白。这需要看具体机器而定。去离子水的使用：转膜液需要用去离子水配制，转膜槽和容器需要用去离子水润洗。转膜液配方需要根据蛋白大小来调整，大蛋白（>100 kD）：SDS 1g，甲醇0ml；小蛋白（<100kD）：SDS 0g，甲醇200ml。通过这些步骤和注意事项，可以更好地进行蛋白免疫印迹实验，确保结果的准确性。

𐟧엂实验的详细步骤解析𐟔 𐟔쨛‹白免疫印迹（Western Blotting）是一种强大的蛋白质检测技术，通过将电泳分离后的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上，再利用特异性抗体来检测特定的蛋白质。𐟒ᤸ‹面是WB实验的详细步骤： 1️⃣ **制胶**：首先，你需要制备一块适合的凝胶。 2️⃣ **上样与电泳**：将样品加载到凝胶上，并进行电泳分离。 3️⃣ **转膜**：将分离后的蛋白质从凝胶转移到NC膜或PVDF膜上。 4️⃣ **洗膜**：用特定的洗涤液清洗膜，以去除未结合的蛋白质和其他杂质。 5️⃣ **封闭**：使用封闭液封闭膜上的非特异性结合位点，以减少背景噪音。 6️⃣ **抗体孵育**：先孵育一抗，再孵育二抗，使抗体与目标蛋白质结合。 7️⃣ **显影曝光**：最后，通过显影和曝光来检测和记录目标蛋白质的存在和丰度。 𐟓𘦯一步都至关重要，确保实验的准确性和可靠性。希望这些步骤能帮到你，祝你实验顺利！𐟌Ÿ

westernblot原理 Western Blot（蛋白免疫印迹）是一种重要的蛋白质检测技术，广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等领域。通过将电泳分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如NC膜或PVDF膜）上，然后用特异性抗体检测特定抗原，实现对蛋白质的定性或定量分析。 𐟔 实验目的研究体外蛋白质分子是否存在研究目的蛋白质的表达情况，如上调或下调，以及在不同样品中的表达差异 𐟎ꌥŽŸ理 Western Blot的主要目的是对蛋白表达进行定性或粗定量。定性是通过观察处理后与未处理相比，某个蛋白是否表达；粗定量则是通过观察某个蛋白表达量的显著升高，表现为条带变粗。检测已知蛋白和未知蛋白的方法类似。对于已知蛋白，根据目的蛋白选择相应的抗体，抗体与目的蛋白特异性结合后，通过引入带有标签的二抗，可以检测到目的蛋白的存在。对于未知蛋白，先在目的蛋白前面加上标签，再选择特异性结合的抗体，整个过程与已知蛋白相同。 𐟓 实验步骤选择内参：内参的选择对于实验的准确性至关重要。膜的选择：根据实验需求选择合适的膜类型。封闭原理：封闭过程中需要注意避免非特异性结合。显色发光常见方法：选择适合的显色和发光方法，以提高实验灵敏度。 𐟒ᠥ𘸨灩—˜解答如何排查WB背景高的问题？如何处理WB有拖带的现象？如何解决WB条带中出现杂带的问题？通过这些步骤和原理的详细解析，你可以更好地理解和掌握Western Blot技术，为科研实验提供有力的技术支持。

𐟌Ÿ 探索P2实验室的奥秘 𐟌Ÿ 𐟏렦Ž⧴⥮ž验室的奥秘，我们拥有1500平方米的P2级实验室，为您的医学、生物和动物实验提供全面的外包服务。 𐟔젥œ訿™里，您可以找到各种先进的实验技术，包括但不限于流式细胞检测、荧光定量PCR检测、免疫组化、IHC、病理染色、Western Blot和蛋白质免疫印迹等。 𐟧젦ˆ‘们不仅提供实验服务，还提供分子生物学和医学实验的指导，涵盖各种载体构建、克隆、PCR、qPCR、WB蛋白检测、ELISA和IF等技术。 𐟑袀𐟏렦ƒ𓨦亲自体验实验操作？我们欢迎您亲自到实验室进行实操，感受科学的魅力。 𐟒ᠩ€‰择我们，就是选择了专业与实力，让我们为您的实验保驾护航。

WB实验必看：如何挑选合适的PVDF膜嘿，大家好！今天咱们来聊聊WB实验中那些让人头疼的PVDF膜问题。相信很多小伙伴在做蛋白质免疫印迹实验（Western Blot，简称WB）时，都遇到过转膜后膜后滤纸上出现蛋白条带的情况吧？其实，这往往是因为选错了PVDF膜，蛋白结合能力不够强。别担心，今天我就来教大家如何挑选合适的PVDF膜，一起来做笔记吧！ PVDF膜是什么？𐟤” 首先，PVDF膜，全称聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride），是蛋白质印迹中常用的一种固相支持物。它对蛋白质有很高的亲和力，机械强度也很高，特别适合用于蛋白质转移和免疫检测。如何选择PVDF膜？𐟤” 选择PVDF膜主要看两个方面：孔径大小和蛋白结合能力。孔径大小很重要𐟓 用于WB实验的PVDF膜主要有两种孔径：0.22um和0.45um。孔径越小，对低分子量蛋白的结合就越牢固。一般来说，大于20kDa的蛋白用0.45um的膜，小于20kDa的蛋白则用0.22um的膜。0.22um的膜内部表面积大约是0.45um的三倍，所以吸附能力更强。总之，根据你的蛋白大小来选择合适的孔径吧！蛋白结合能力是关键𐟒ꊊPVDF膜的蛋白结合能力越强，蛋白质就越容易通过疏水作用吸附在膜上。目前，像Millipore、GE等国外的公司都有蛋白结合性能不错的PVDF膜，但价格偏高。好在我们国内也有不少不错的选择，比如BIOG的PVDF膜。实验对比𐟔슊我们实验室最近购入了两款PVDF膜，发现BIOG的PVDF膜蛋白结合能力更强。在相同的电转条件下，BIOG的膜上的蛋白条带更清晰，而另一款膜的部分蛋白已经透过转移到滤纸上。这说明BIOG的PVDF膜蛋白结合能力更强，机械强度和耐热稳定性也不错。如果你经常做WB实验，可以试试看哦！小贴士𐟓 最后提醒大家，PVDF膜具有高度疏水性，所以在浸入转印缓冲液之前，必须先用甲醇浸湿进行预处理。用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电的蛋白结合。希望这些小技巧能帮到大家，让你们的WB实验更加顺利！如果有其他问题，欢迎留言讨论哦！𐟒쀀

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【中山大学/南华大学合作发文：乳腺癌的潜在治疗靶点】本研究中，研究人员利用实时PCR、蛋白质免疫印迹实验和免疫组织化学对BC患者样本中的TBL2表达进行了分析，还采用Kaplan-Meier生存分析评估其预后意义。研究人员采用蛋白质组学分析、免疫沉淀试验和蛋白质免疫印迹法研究TBL2对AKT磷酸化激活的影响。网页链接

【PNAS∣北京大学罗建沅/申占龙/纪建松团队合作揭示化疗药物耐药的新机制】化疗是临床上治疗肿瘤的主要手段之一。它通过杀死或抑制癌细胞的生长和分裂，从而达到控制肿瘤、减小肿瘤体积或缓解症状的目的。然而肿瘤细胞反复接受化疗药物导致的化疗耐药问题极大地限制了其对肿瘤细胞的杀伤效果。目前化疗药物耐药的机制主要包括：药物外排，药物代谢改变，表观遗传的改变和肿瘤的异质性等。但是化疗药物耐药的发生与肿瘤微环境之间的联系却鲜有报道。肿瘤细胞自身能否通过影响肿瘤微环境进而影响化疗药物的疗效也尚不明确。环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase，cGAS）是细胞质中一个DNA传感器，能够识别非自身DNA，并通过生成环状GMP-AMP (cGAMP)来激活STING通路，进而引发干扰素等免疫反应。近年来研究发现其在肿瘤免疫相应中也发挥着重要功能。然而在肿瘤化疗过程中，化疗药物介导的cGAS所参与的肿瘤免疫调控尚不明确。因此，揭示具体的调控机制将有助于明确化疗药物的免疫调节潜力，并可能为新的抗癌免疫治疗策略提供依据。 2024年10月3日，北京大学基础医学院罗建沅教授联合北京大学人民医院申占龙教授和丽水市中心医院纪建松教授课题组联合在PNAS杂志上发表了题为“LAMTOR1 ablation impedes cGAS degradation caused by chemotherapy and promotes antitumor immunity”的最新研究成果。此研究发现化疗药物诱导的双链DNA片段会促进LAMTOR1-cGAS-p62复合物的形成，促进cGAS的溶酶体途径降解，从而抑制cGAS信号通路的激活以及IFN-š„产生，进而削弱化疗药物诱导的抗肿瘤免疫。而LAMTOR1的缺失能增强肿瘤微环境中抗肿瘤T淋巴细胞的浸润，进而抑制肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的生存期。为了探索化疗药物对cGAS蛋白水平的影响，研究人员选取乳腺癌或直肠癌病人化疗前后的肿瘤组织进行免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）染色。结果显示，cGAS的蛋白水平在化疗后降低。通过构建荷瘤小鼠以及肿瘤细胞系的给药模型，进行蛋白免疫印迹实验，发现多种化疗药物都能够使肿瘤细胞中的cGAS蛋白水平降低；而荧光定量PCR实验却发现化疗药物使cGAS的mRNA水平升高。这说明化疗药物是通过促进cGAS蛋白的降解从而降低肿瘤细胞中cGAS的蛋白水平。进一步的实验发现，化疗药物诱导的cGAS蛋白降解可以被溶酶体抑制剂而非蛋白酶体抑制剂阻滞，说明化疗药物诱导的cGAS蛋白降解是由溶酶体途径介导。为了找到在化疗药物处理的情况下，介导cGAS进入到溶酶体中降解的中间蛋白，研究人员采用蛋白免疫沉淀/蛋白质谱分析鉴定出了一系列在化疗药物（5-氟尿嘧啶）处理后与cGAS结合增强的蛋白，并与已知的溶酶体定位蛋白取交集，最后鉴定出晚期内体/溶酶体接头蛋白和MAPK和MTOR激活蛋白1（Late Endosomal/Lysosomal Adaptor and MAPK And MTOR Activator 1，LAMTOR1）可能介导了化疗药物诱导的cGAS溶酶体途径降解。利用蛋白免疫共沉淀，GST pull-down，免疫荧光以及微量热泳动（MicroScale Thermophoresis，MST）等实验确证了LAMTOR1与cGAS之间存在相互作用，并且化疗药物诱导的双链DNA片段能增强两者的结合并促进LAMTOR1的表达。最后，通过基因沉默和过表达实验，确定了化疗药物诱导的cGAS蛋白降解是由LAMTOR1介导的。由于LAMTOR1并不是溶酶体选择性降解途径中的经典受体蛋白，所以LAMTOR1可能只是作为骨架蛋白，通过增强cGAS与受体蛋白的结合，从而促进cGAS进入溶酶体被降解。为了鉴定出该受体蛋白，研究人员将LAMTOR1相互作用蛋白组与cGAS相互作用蛋白组取交集，发现已被报道的溶酶体受体蛋白SQSTM1/p62是LAMTOR1与cGAS共同的结合蛋白。通过免疫共沉淀和免疫荧光等实验，证实了LAMTOR1能够增强cGAS与p62的结合，进而促进cGAS被招募到溶酶体中降解。cGAS的主要功能是识别胞浆中的双链DNA，激活下游STING-TBK1-IRF3通路，启动干扰素-𜈉nterferon-beta，IFN-𜉧š„转录。于是，通过荧光定量PCR，荧光素酶报告基因检测和转录组测序等实验，研究人员证明了LAMTOR1的缺失能够促进cGAS通路的激活，以及IFN-š„表达。进一步通过小鼠成瘤实验、组织免疫荧光和流式细胞术等实验发现LAMTOR1的缺失可以增加肿瘤微环境中抗肿瘤T淋巴细胞的浸润，进而抑制肿瘤的生长。最后，研究人员发现LAMTOR1的缺失能与免疫治疗或化疗产生显著的协同作用，最大程度地抑制肿瘤的生长。本研究首次发现LAMTOR1是cGAS的结合蛋白，LAMTOR1通过下调cGAS的蛋白水平来抑制抗肿瘤免疫。LAMTOR1的缺失能通过增强cGAS介导的抗肿瘤免疫抑制小鼠肿瘤的生长并延长荷瘤小鼠的生存期。本研究为通过靶向LAMTOR1设计新型的抗肿瘤药物提供了理论依据。北京大学基础医学院已毕业博士生，北大医学部（泰州）医药健康产业创新中心高级研究员别俊涛博士和北京大学基础医学院已毕业博士生李雨桐博士为该论文的共同第一作者。北京大学基础医学院罗建沅教授、北京大学人民医院申占龙教授、丽水市中心医院纪建松教授为共同通讯作者。感谢北京大学医药卫生分析中心的苏黎老师和娄雅欣老师对该课题的帮助以及国家自然科学基金面上项目和浙江省自然科学基金项目对该研究的资助与支持。文章链接：网页链接

蛋白质印迹法：从实验原理到应用场景 1. 𐟔젥ꌥŽŸ理 Western免疫印迹是一种将蛋白质转移到膜上，并通过抗体进行检测的方法。已知表达蛋白的检测可以使用相应的抗体作为一抗，而新基因表达产物的检测则可以通过融合部分的抗体来实现。与Southern或Northern杂交方法类似，Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 𐟓 实验流程（待补充） 𐟓Š 实验周期及交付结果形式 12个工作日内完成黑白显色图（带Marker）、内参、灰度值分析、柱状图、实验报告 𐟓ˆ 应用场景从蛋白质混合物中检出目标蛋白质定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析

电转液 Western Blot（WB），即蛋白质免疫印迹法，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中的经典实验方法。它基于抗原-抗体的特异性结合，通过SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白，最终通过显色技术检测目的蛋白。在进行WB实验的过程中，我积累了一些心得，分享如下：制胶小贴士 𐟧ꊨ‡ꥷ𑥈𖨃𖦗𖯼Œ玻璃片要完全洗干净，用纯水润洗后烘干。灌胶时不要用手拿灌胶的地方，因为手套上可能有灰尘和指纹。按比例配置下层胶，注意一定要放久一点，让下层胶完全凝固（五十分钟，如果室温低，可以加二倍的APS）。压胶时用纯水，加上层胶要速度快，然后立刻插上梳子。电泳液和电转液的使用 𐟌Š 电泳液和电转液要现配现用，旧的电泳液可以放在电泳槽外侧，内侧用新的。转膜液用新的，最多用两次，并且补无水甲醇（如果用回收的）。不同分子量的蛋白，尤其是大分子和小分子，一般要用不同的电转时间。据说分子量多少，转膜多少分钟（如果你的转膜是恒压95V），转过或者没转完，都会影响后续显色出的条带。一抗的选择 𐟒‰ 一抗不要贪图便宜买差的，CST的真的很好用，虽然贵了但是可以出结果。我们之前用affinity的孵不出来，换CST的就OK。个人经验分享 𐟓– 在进行WB实验时，自己要算好需要配几块胶，不要浪费。如果不确定，多配两毫升也是可以的。希望这些小贴士能帮助你更好地进行Western Blot实验！

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