3.25蛋白免疫印迹实验（跑WB）2
平平无奇的科研日常
一、实验所需试剂器材
蛋白样品、marker、上下层胶溶液、上下层胶缓冲液、改良促凝剂、甲醇、电转液、TBST、电泳液、电泳仪、电泳槽、硝酸纤维素膜、封闭液、吸管、 剪刀，记号笔等
二、实验步骤
1、配胶
①将2块厚玻璃片和2块薄玻璃片放于装有蒸馏水的盒内消洗
②两玻璃片对齐后放入绿色架子中夹紧，用三纯水加满两片玻璃片中十分钟，检查是否漏水。若无漏水，将水倒掉并用滤纸吸干水。
③配制下层胶：取下层胶溶液+下层胶缓冲液+改良促凝剂于小烧杯搅拌均匀后用吸管吸取加入两玻璃片中，加1ml异丙醇封胶，将胶凝固。（每块下层胶溶液2.7ml+下层胶缓冲液2.7ml+促凝剂60ul（按需配制几块））
④胶凝固后，倒掉异丙醇，配制上层胶溶液：上层胶溶液+上层胶缓冲液+促凝剂，搅拌混匀后用吸管加入两玻璃片中，插入梳子待凝固，将预先提取好的蛋白样品拿出，室温下溶解。
⑤将架子移置电泳槽，夹上电泳夹：同色相夹，倒入电泳液：先倒满盒内，再倒至刻度线；
⑥上样：拔掉梳子，用移液枪小心加入marker和蛋白（第一格先加marker，手要稳，缓慢加入。
⑦电泳：电压80v，110min，待条带清晰后，调电压至120v，并观察是否冒泡。
（电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳，而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。）
溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳，或者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况，预计目的蛋白已经被适当分离后即可停止电泳。
2、转膜
⑧将转膜所用的纸带剪成4×3cm左右大小，在纸上写上标记，将电泳液倒掉取出胶放在装有电转液的盘子里，将所需条带切下后，先将剪好的电转膜泡在装有甲醇的盒子中（十几秒即可），浸湿后盖在已切好的胶上，再盖上滤纸和海绵，压紧后放入槽内。（膜和胶之间不能产生气泡）电转液加满电转槽至刻度线，调电流290A，90min，并在槽周围加上冰块降温
3、孵抗体及曝光
⑨转膜成功后，取出膜纸，用滤纸吸干后放入封闭液中封闭1.5h，封闭后用TBST洗3遍，滤纸吸干后放入一抗4℃过夜
⑩将膜纸从一抗液体中取出，TBST洗3遍，10min/次，加入二抗90min，室温，TBST洗3次，10min/次，配曝光液（现用现配），按1：1配制，后曝光，看条带是否清晰。