一种纳升光电离质谱离子源装置及其操作方法与流程

1.本技术涉及纳升光电离质谱离子源装置的领域，尤其是涉及一种纳升光电离质谱离子源装置及其操作方法。


背景技术：

2.质谱分析法（mass spectrometry, ms）是一类具有高通量、高灵敏度以及较强化合物鉴定能力等特点的生化样品分析技术。为了满足生物小体积样品准确测量的迫切需求，微型化和集成化已经成为质谱仪发展的重要方向，以实现小体积痕量生物组分的高通量分析及准确测量的目标。
3.纳喷雾离子源（nano-esi）是一种广泛适用于小体积极性化合物分析的高灵敏度“软电离”离子源。相比于普通电喷雾离子源（esi），nano-esi具有更小的电喷雾喷嘴内径，从而可以实现小体积及单细胞样本精准采样过程，有着更高的离子化效率和更长的ms谱图解析时间。nano-esi通常情况下会将小体积溶液样品置于纳喷雾喷针（nano-tip），通过电极向样品溶液施加高压电（1
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2 kv）。在高压电场的作用下，样品溶液从nano-tip尖端喷出，形成电喷雾。基于nano-esi的小体积分析方法一般使用nano-tip进行取样。在显微镜的实时观测下，通过三维移动机械臂控制nano-tip从活体生物样本的目标区域直接取样。取样后，可通过nano-esi进行直接离子化检测，或通过与毛细管电泳等分离技术联用，对不同化合物进行分离，然后再检测。虽然目前基于nano-esi的分析方法已经成功应用于各类小体积及单细胞极性化合物的超灵敏分析研究，然而对于小体积及单细胞弱极性化合物的痕量物质分析却仍存在着检测灵敏度低、离子化效率差、复杂基质的干扰等问题。
4.大气压化学电离（apci）与大气压光致电离（appi）是两种适用于弱极性化合物和非极性化合物常量分析的常压质谱离子源。其中，apci主要针对部分极性化合物和弱极性化合物难以离子化的问题，借助电晕放电产生试剂离子，再通过试剂离子与被分析物的气相离子/分子反应，将被分析物高效离子化。相比于apci，appi往往应用于极性更弱的弱极性化合物和非极性化合物的分析，它通常利用低波长紫外光激发气态被分析物，使其离子化为自由基阳离子或进一步被分析物质子化生成离子。尽管目前对于弱极性或者非极性化合物的大体积常量分析可以采取apci和appi途径，但是对于小体积单细胞样品中痕量弱极性物质往往难以实施有效的质谱离子化过程。
5.因此，如何优化单细胞质谱分析过程中小体积痕量弱极性化合物出现的离子化效率低、灵敏度差、杂质干扰多等问题是目前待研究的方向。


技术实现要素：

6.为了减少单细胞质谱分析过程中小体积痕量弱极性化合物出现的离子化效率低、灵敏度差、杂质干扰多的问题，本技术提供一种用于痕量弱极性化合物分析的纳升光电离质谱离子源装置及其操作方法。
7.第一方面，本技术提供一种纳升光电离质谱离子源装置，采用如下的技术方案：
一种纳升光电离质谱离子源装置，包括纳喷雾喷针：用于装载样品溶液，实现纳喷雾过程；金属电极：插入所述纳喷雾喷针内，与样品溶液直接接触，向样品溶液提供高压电场；紫光灯：用于发射高能量紫外光子，与样品溶液雾化的气相分子结合，实现光离子化过程。
8.通过采用上述技术方案，当向纳喷雾喷针中施加高压时，会使纳喷雾喷针中的待测样品雾化，形成气态分子，并与紫光灯发射的高能量紫外光子结合，从而实现光离子化过程，最终实现待测物的质谱检测。
9.可选的，还包括方形腔体，所述纳喷雾喷针端部以及所述紫光灯均位于所述方形腔体内，所述方形腔体内填充有惰性辅助气体以减少高能量紫外光子受空气中氧气的影响。
10.通过采用上述技术方案，可以减少空气中氧气对紫光灯发射的高能量紫外光子的传输影响，保证更多的高能光子保存下来与样品结合。
11.可选的，所述惰性辅助气体为氮气。
12.可选的，所述方形腔体上开设有供惰性辅助气体进入和排出的气路进口和气路出口，所述气路进口和所述气路出口分别位于所述方形腔体相对的两侧。
13.可选的，所述方形腔体上开设有气路进口的一侧开设有掺杂剂入口。
14.可选的，所述纳喷雾喷针为硼玻璃材质制成的纳喷雾喷针。
15.可选的，所述金属电极为惰性金属材料。
16.可选的，所述惰性金属材料为铂丝。
17.第二方面，本技术提供一种纳升光电离质谱离子源装置的操作方法，采用如下的技术方案：一种纳升光电离质谱离子源装置的操作方法，利用上述纳升光电离质谱离子源装置实现，包括以下步骤s1：进样，将样品溶液从纳喷雾喷针尾端注入，使得样品溶液充满纳喷雾喷针的尖端；s2：连接，将金属电极一端从纳喷雾喷针的尾端插入，直至金属电极端部与样品溶液接触，用绝缘端盖封住纳喷雾喷针的尾端，将金属电极位于纳喷雾喷针外部的一端连接至外置高压电源；s3：检测，打开紫外灯，开启高压电源，实现检测。
18.可选的，所述s3检测时，将氮气和掺杂剂通入方形腔体内后，再接通高压电源。
19.综上所述，本技术包括以下至少一种有益技术效果：1.实现了对小体积单细胞等样品中多环芳烃的高灵敏检测，获得更高的信号强度和信噪比结果，相比于nano-esi得到了信号强度增强（1
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2个数量级）；2.更好的选择性。对混合样品中弱极性化合物（尤其是带有芳香族的化合物）具有更好的检测响应；3.相比于普通的appi离子源无需稀释，样品消耗量更小；4.实现单细胞中弱极性化合物多环芳烃的检测；
5.装置结构简单，操作简单方便。
附图说明
20.图1是本技术开放式nano-appi的整体结构示意图。
21.图2是本技术氮气保护nano-appi的整体结构示意图。
22.图3(a)是氮气保护nano-appi对苯并[a]蒽的质谱检测结果示意图。
[0023]
图3(b)是开放式nano-appi对苯并[a]蒽的质谱检测结果示意图。
[0024]
图3(c)是常规nano-esi对苯并[a]蒽的质谱检测结果示意图。
[0025]
图4是六种多环芳烃化合物在不同浓度下的三种质谱离子源的检测结果：(a) 荧蒽；(b) 苯并[a]蒽；(c) 䓛
；(d) 苯并[k]荧蒽；(e) 茚并[1,2,3-cd]芘；(f) 二苯并[a,h]蒽。
[0026]
图5是六种多环芳烃化合物在氮气保护nano-appi质谱下的检测结果：(a) 茚并[1,2,3-cd]芘；(b) 二苯并[a,h]蒽；(c) 荧蒽；(d) 苯并[a]蒽；(e) 苯并[k]荧蒽；(f) 䓛
。
[0027]
图6是六种多环芳烃化合物在nano-esi质谱下的检测结果：(a) 茚并[1,2,3-cd]芘；(b) 二苯并[a,h]蒽；(c) 荧蒽；(d) 苯并[a]蒽；(e) 苯并[k]荧蒽；(f) 䓛
。
[0028]
图7是六种混标样品在nano-esi和nano-appi质谱下的检测结果示意图。
[0029]
图8是经苯并[a]蒽处理后的k562单细胞样品在nano-esi和nano-appi质谱下的检测结果示意图。
具体实施方式
[0030]
以下结合附图1
−
8对本技术作进一步详细说明。
[0031]
本技术实施例公开一种纳升光电离质谱离子源装置，用于进行质谱检测实验，该质谱检测实验在orbitrap elite mass spectrometry（thermo scientific, san jose, ca, usa）上完成，设备参数可设置为：毛细管温度（capillary temperature）为275 ℃；喷雾电压（spray voltage）为+3.0 kv。
[0032]
实施例1参照图1，纳升光电离质谱离子源装置包含开放式纳升光电离质谱离子源装置（nano-appi），开放式nano-appi的光离子化过程是在大气压状态下进行的，开放式nano-appi包括：纳喷雾喷针：用于装载样品溶液；并提供开放式nano-appi的发生场所，纳喷雾喷针的材质为玻璃，具体的为硼玻璃，纳喷雾喷针的尖端内径为2
−
5 μm。样品溶液从纳喷雾喷针尾端注入，充满纳喷雾喷针的尖端；当然也可以在纳喷雾喷针的尖端通过毛细作用吸入，尾端再添加溶液辅助导电。
[0033]
金属电极：插入所述纳喷雾喷针内，与样品溶液直接接触，向样品溶液提供开放式nano-appi发生所需的高压电场；金属电极的材质不限，但应具有化学惰性，不易与样品溶液发生化学反应导致腐蚀和溶解。一般为惰性金属材料，具体的可以为铂丝。
[0034]
紫光灯：用于发射高能量紫外光子，与样品溶液雾化的气态分子结合，实现光离子化过程。使用贺利氏psk106紫外激发灯，内部填充kr稀有气体，激发能量为10.6 ev，紫外线波长为117 nm。
[0035]
实施例1的实施原理为：在orbitrap质谱仪上质谱椎孔体的进样口与纳喷雾探针尖端之间放置一根内填充有稀有气体的柱状紫外灯，紫外灯位于质谱椎体进样口与纳喷雾探针尖端下方1 cm处，通过使用外界平移架等辅助设备将紫外灯固定，确保紫外灯与纳喷雾探针尖端喷射的气态样品分子的距离保持一致。当向纳喷雾探针中施加高压时，会使纳喷雾探针中的待测样品溶液雾化，形成气相分子，并与处在纳喷雾探针尖端下方的紫外灯发射的高能量紫外光子结合，从而完成光离子化过程，最终实现待测物的质谱检测。
[0036]
实施例2参照图2，纳升光电离质谱离子源装置包含氮气保护的纳升光电离质谱离子源装置（nano-appi），该氮气保护的nano-appi与开放式nano-appi的区别之处在于，氮气保护的nano-appi还包括方形腔体，纳喷雾喷针端部以及紫光灯均位于方形腔体内，方形腔体内填充有惰性辅助气体以降低空气中氧气对高能量紫外光子的影响。同时在方形腔体上开设有供纳喷雾喷针插入的样品进样口，样品进样口直径设计为1 mm。
[0037]
具体的，惰性辅助气体可选用氮气，在方形腔体上开设有供氮气进入和排出的气路进口和气路出口，气路出口的直径设计为0.5 mm，气路进口和气路出口分别位于方形腔体相对的两侧，以使得整个方形腔体内保持惰性气体的循环。当对方形腔体内持续通入氮气时，方形腔体内的空气会被有效排出，并在整个方形腔体内充满氮气，且有效保持方形腔体内氮气的浓度。在方形腔体上还开设有掺杂剂入口，掺杂剂入口可以开设在方形腔体朝向气路进口的一侧，也可以直接连通在气路进口侧壁上。方形腔体的设计，可以使紫外灯发射的高能量紫外光子在传输时不受空气中氧气的影响，保证更多的光子保存下来与样品溶液所雾化形成的气相分子结合，排除了空气中氧气的干扰。
[0038]
其中，方形腔体的材料可选用聚合物聚砜，该材料热稳定性较好，可以保证光离子化过程中较高的离子化温度。
[0039]
实施例2的实施原理为：将纳喷雾喷针的尖端通过样品进样口插入到充氮气的方形腔体内，且纳喷雾喷针的尖端与orbitrap质谱仪上质谱椎孔体的进样口的距离保持在5 mm左右。将氮气和掺杂剂连接至方形腔体内，然后将紫外灯安装在方形腔体内，且使得紫外灯与纳喷雾喷针的尖端保持5 mm的固定距离，并将紫外灯连接高压电模块使其通电发光。通过氮气可以降低紫外灯发射的高能量紫外光子在传输时受空气中氧气的干扰，进一步提高了弱极性化合物的离子化效率。
[0040]
本技术实施例还公开一种纳升光电离质谱离子源装置的操作方法。纳升光电离质谱离子源装置的操作方法包括以下步骤：s1：进样，将样品溶液从纳喷雾喷针尾端注入，使得样品溶液充满纳喷雾喷针的尖端；s2：连接，在样品溶液注入完成后，将金属电极一端从纳喷雾喷针的尾端插入，直至金属电极端部与样品溶液接触，用绝缘端盖封住纳喷雾喷针的尾端，将金属电极位于纳喷雾喷针外部的一端连接至外置高压电源；s3：检测，打开紫外灯，接通高压电源，实现检测。
[0041]
以上步骤为针对开放式nano-appi的操作方法，在针对氮气保护的nano-appi进行操作时，在步骤s3中还需要先将氮气和掺杂剂通入方形腔体中，然后再接通外置高压电源，实现检测。其中，通入氮气和掺杂剂时，氮气的流速为400 ml/min，掺杂剂流速100 ml/min。
[0042]
下面将通过具体的实施例验证纳升光电离质谱离子源装置的检测效果。
[0043]
（1）三种离子源的检测效果对比为了更好证明设计搭建的开放式nano-appi离子源和氮气保护的nano-appi离子源对弱极性化合物的检测优势，我们将氮气保护nano-appi离子源、开放式nano-appi离子源和常规nano-esi离子源进行了对0.1 mmol/l的苯并[a]蒽质谱检测灵敏度的对比验证。
[0044]
参照图3，为三种自搭建的离子源对苯并[a]蒽的质谱检测结果对比图，其中，检测中所用苯并[a]蒽为环境毒物标准品，分子量为228。溶解于乙腈中得到0.1 mmol/l待测溶液样品，直接用于检测。我们选取150
−
500 m/z范围进行数据采集，待测物信号用箭头标注。
[0045]
参照图3（a）中所示，氮气保护的nano-appi离子源展现出对苯并[a]蒽最佳的检测灵敏度，信噪比（signal-to-noise, s/n）可达到155。如图3中（b）所示，开放式nano-appi离子源对苯并[a]蒽检测灵敏度明显下降，s/n仅达到42。如图3中（c）所示，常规的nano-esi离子源对苯并[a]蒽几乎难以实现检出，无法看到特征信号，s/n结果趋近于0。结果证明，半封闭式的nano-appi离子源在氮气保护的情况下，可以更好地排除氧气分子的干扰，提升光子与样品的结合率，极大程度提高了光离子化效率。而开放式的nano-appi离子源会受到氧气分子的干扰，光子会与氧气分子结合，降低目标分子的离子化效率。而常规的nano-esi离子源因为缺少紫外光的辅助，对于苯并[a]蒽这种缺少离子化官能团的弱极性化合物，往往难以离子化。
[0046]
进一步进行了不同浓度pahs的检测结果实验，如图4所示。六种pahs分别在1.0 mmol/l至0.1 μmol/l五种浓度下进行试验，获取了不同浓度下常规nano-esi、开放式nano-appi以及氮气保护nano-appi离子源的检测s/n结果。
[0047]
nano-esi离子源对六种pahs的检出s/n都很低且趋近于0，并且当待测样品的浓度从1.0 mmol/l至0.1 μmol/l进行变化时，nano-esi离子源的检出s/n结果也是近似一条直线的趋势，即便高浓度1.0 mmol/l的pahs样品也没有获得相对较高的nano-esi离子源质谱检测信号，每种pahs的每个浓度下进行三次重复实验，均呈现相同的nano-esi离子源检测s/n趋势。因此说明nano-esi离子源无法对pahs实现有效的离子化检测，可以确定nano-esi离子源不能实现对弱极性化合物pahs的有效离子化。
[0048]
在开放式nano-appi离子源检测下，随着pahs样品的浓度由高到低，开放式nano-appi离子源对应的检出信号也是由高到低的趋势，且均高于该浓度下的背景s/n和nano-esi离子源的s/n。检出平均s/n为1.0
ꢀ×ꢀ
101数量级，较高质量数的pahs样品的检出s/n可以达到1.0
ꢀ×ꢀ
102数量级。且在1.0 μmol/l时的检出s/n小于3。因此开放式nano-appi离子源的检出限为1.0 μmol/l。而且发现低质量数pahs样品的检出s/n高于相同浓度下高质量数的pahs样品的检出s/n。
[0049]
此外，在氮气保护nano-appi离子源检测下，随着pahs样品浓度的降低，氮气保护nano-appi离子源对应的检出信号也展现出由高到低的变化趋势，且均高于该浓度下的背景s/n、nano-esi离子源和开放式nano-appi离子源的检出s/n。此外，1.0 mmol/l浓度下低质量数的pahs样品（荧蒽、苯并[a]蒽、
䓛
、苯并[k]荧蒽）可达到1.0
ꢀ×ꢀ
102数量级的s/n，而相同浓度下高质量数的pahs样品（茚并[1,2,3-cd]芘和二苯并[a,h]蒽）可达到1.0
ꢀ×ꢀ
103数量级的s/n。在较低浓度0.1 μmol/l时的检出s/n也可达到1.0
ꢀ×ꢀ
101以上。因此可以说明，氮气保护nano-appi离子源可以实现弱极性化合物的有效电离，且检出限可到达0.1 μ
mol/l。
[0050]
（2）氮气保护的nano-appi离子源对各类多环芳烃的检测在此，选取了六种相同浓度（0.1 mmol/l）不同种类的pahs（荧蒽，苯并[a]蒽，
䓛
，苯并[k]荧蒽，二苯并[a,h]蒽，茚并[1,2,3-cd]芘）进行了氮气保护的nano-appi和nano-esi的对比检测实验，结果参照图5和图6。
[0051]
参照图5，展示了六种pahs在氢气保护的nano-appi中的质谱检测结果，图中展现了自制的氮气保护nano-appi装置较好的离子化效率。几种pahs检测s/n结果分别为：荧蒽：79.47；苯并[a]蒽：141.38；
䓛
：112.56；苯并[k]荧蒽：378.06；茚并[1,2,3-cd]芘：1058.11；二苯并[a,h]蒽：1243.31。
[0052]
参照图6，展示了六种pahs在nano-esi中的质谱对比检测结果，结果均展示出较差的检测灵敏度，无法准确捕获目标化合物的信号，s/n结果均趋于0。
[0053]
结果表明，设计的氮气保护nano-appi离子源显著提高了对弱极性化合物pahs的离子化效率，提高了对这类弱极性化合物的检测效率，为小体积弱极性化合物的痕量分析提供基础。
[0054]
（3）氮气保护的nano-appi离子源在混标样品下的检测为了进一步说明所设计的氮气保护nano-appi质谱平台在复杂物质环境中对弱极性化合物的检测效果，选取三种pahs化合物和三种常规的极性化合物进行了氮气保护的nano-appi和nano-esi的质谱检测。该标准混合样品含有0.1 mmol/l的
䓛
、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽、组氨酸、精氨酸和蔗糖，该混标样品被溶解于纯乙腈溶剂中。
[0055]
参照图7，分别为六种混合标准样品在nano-esi离子源和氮气保护nano-appi离子源的质谱结果图。通过使用nano-esi离子源对六种混合待测样品进行检测，组氨酸、精氨酸和蔗糖三种极性较强的物质可以被较好检测出来，但对应质谱信号峰的相对信号强度较低。三种弱极性化合物pahs：
䓛
、苯并[k]荧蒽、二苯并[a,h]蒽难以被检测出来，在质谱图中对应的m/z几乎没有呈现。说明nano-esi离子源质谱平台更易于实现对极性化合物的检测，对极性较弱的物质不好实现质谱离子化检测过程。与之对比，氮气保护nano-appi离子源质谱平台可以实现
䓛
、苯并[k]荧蒽和二苯并[a,h]蒽三种弱极性物质的较好检测，获取高s/n的质谱信号峰，背景干扰较少。但是对三种极性化合物氨基酸和蔗糖没有很高的检测信号强度，推测nano-appi具有较好的选择性离子化功能，对弱极性化合物的光离子化效率大于对极性化合物的离子化效率。使得离子化后弱极性离子的浓度大于极性离子的浓度，从而低浓度的物质没有被检测出来。而且还可以看出，氮气保护nano-appi离子源质谱平台检出的二苯并[a,h]蒽对应的m/z质谱信号峰的相对信号强度最高，苯并[k]荧蒽对应m/z质谱信号峰的相对信号强度次之，
䓛
对应的m/z质谱信号峰的相对信号强度最低，证明该氮气保护nano-appi离子源更适用于高分子量化合物的离子化检测。综上所述，nano-esi离子源质谱平台更易于实现极性物质的离子化检测分析，氮气保护nano-appi离子源质谱平台更易于实现在复杂的样品环境中弱极性化合物的高效检测。
[0056]
（4）氮气保护的nano-appi离子源在单细胞样品下的检测结果许多环境中的污染物会进入生物细胞内，与细胞内的特定受体结合，经过代谢酶的转化，最终影响细胞的生长和发育。多环芳烃（pahs）是一类对人体非常有害的细胞污染物，它通过与特异受体结合经过代谢转化为pahs的离子形式，与细胞内的遗传物质dna或
rna结合，导致细胞变异，从而造成细胞癌变。检测单细胞中的物质不仅包括细胞自身含有的六大类主要化合物，还包括一些从环境中吸收的物质。检测单细胞中的弱极性化合物pahs，对以后疾病的预防和诊断、环境治理以及食品药品中有害成分的控制具有重要意义。本技术继续将氮气保护nano-appi-ms对在苯并[a]蒽处理培养后的k562细胞，进行细胞中的弱极性化合物pahs的检测（如图8所示）。
[0057]
从以上质谱图结果中可得知，氮气保护的nano-appi离子源可以成功检测出k562细胞中的苯并[a]蒽，同时还检测出细胞内的其他弱极性化合物如黄酮类化合物。通过与常规的nano-esi离子源对比可以发现，nano-esi常规离子源难以实现苯并[a]蒽的有效检出，而nano-appi可以较好实现弱极性化合物如pahs的单细胞检测，并展现出极好的s/n结果。并且nano-appi也可以检测出一些nano-esi难以检测的内源性单细胞的弱极性化合物，如黄酮类化合物。
[0058]
在k562细胞检测实验中得到的质谱图可以看出，氮气保护的nano-appi可以有效实现单细胞中弱极性化合物的高灵敏检测。此外，我们发现我们研制的nano-appi离子源不仅可以实现外源性的弱极性化合物检测还可以实现监测内源性弱极性代谢物的分析。
[0059]
以上均为本技术的较佳实施例，并非依此限制本技术的保护范围，故：凡依本技术的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本技术的保护范围之内。