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聚合酶链反应权威发布_聚合酶链式反应的步骤(2024年11月精准访谈)

内容来源：冲顶技术团队所属栏目：观点更新日期：2024-11-27

聚合酶链反应

SNHG9如何调控EV-D68？今天我们来聊聊一篇发表在《Frontiers in Microbiology》杂志上的文章，标题是《Long non-coding RNA SNHG9 regulates viral replication in rhabdomyosarcoma cells infected with enterovirus D68 via miR-150-5p/c-Fos axis》。这篇文章主要研究了长链非编码RNA（lncRNA）SNHG9在横纹肌肉瘤细胞感染肠病毒D68时的调控机制。背景介绍 𐟌 肠病毒D68（EV-D68）的流行让人们更加关注这种病毒，因为它可以导致严重的呼吸道和神经系统疾病。研究表明，lncRNAs通过多种机制或信号通路调节病毒的复制和感染。然而，lncRNA在EV-D68感染中的确切功能尚不清楚。研究结果 𐟔슥𛺧닅V-68细胞感染的体外模型：首先，作者们建立了一个体外模型，模拟EV-D68感染横纹肌肉瘤细胞的过程。差异表达分析：通过差异表达分析，发现了一些关键lncRNAs，其中SNHG9特别引人注目。靶基因预测和网络调控定位：作者们预测了SNHG9的靶基因，并定位了相关的网络调控。 KEGG、GO通路分析：通过KEGG和GO通路分析，进一步了解了SNHG9的靶基因功能。定量逆转录聚合酶链反应验证：为了验证测序结果的准确性，作者们进行了定量逆转录聚合酶链反应。 SNHG9/miR-150-5p/c-Fos轴验证：最后，作者们验证了SNHG9通过miR-150-5p/c-Fos轴调节EV-D68感染RD细胞过程中的病毒复制。

𐟔젒T-PCR实验全攻略：从原理到实践 𐟓š 目录 cDNA与反转录 RT-PCR原理与目的 RNA抽提与质量检测反转录过程 PCR程序与引物设计 PCR酶与体系 PCR产物检测实时荧光定量PCR（RT-qPCR）常见问题与注意事项 𐟔젣DNA与反转录 cDNA（互补DNA）：与RNA链互补的单链DNA。在适当引物的存在下，由DNA聚合酶即反转录酶合成的单链DNA就是cDNA。反转录（Reverse Transcription）：在反转录酶的作用下，以RNA为模板合成DNA的过程。合成的DNA链称为与RNA互补的DNA，即cDNA。 𐟔젒T-PCR原理与目的原理：RT-PCR全称反转录聚合酶链反应（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction），将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。目的：检测核酸的表达，主要是RNA的表达。DNA不需要反转录的过程，直接PCR检测即可。 𐟔젒NA抽提与质量检测 RNA抽提方法：TRIzol法。主要成分包括苯酚，用于裂解细胞和变性蛋白。 RNA质量检测：分光光度计测定、凝胶电泳法。 𐟔젥转录过程以RNA为模板合成cDNA的过程。在这个过程中，遗传信息的流动方向与转录时相反，因此称为“反转录”。需要反转录酶，合成的DNA称为与RNA互补的DNA（cDNA）。根据不同情况选择不同的反转录引物。 𐟔점CR程序与引物设计 PCR程序：三步法，包括变性、退火和延伸三个基本反应。引物设计：找到目的基因的CDS序列，用软件设计和评价引物，并使用BLAST进行引物特异性检测。引物长度为15-30bp，最常用的为23bp；引物Tm值介于62-73℃之间，上下游引物Tm最好相近以保证其能高效工作；3'-端的Tm值要低于5'端；引物GC含量约为40-60%；避免扩增模板的二级结构域；避免引物的二级结构；避免与靶DNA错配。 𐟔점CR酶与体系 PCR酶：可选择普通的Taq酶、可扩增长片段的Taq酶或高保真酶。 PCR体系：按所选的PCR酶说明书来配制。 𐟔점CR产物检测一般采用琼脂糖凝胶电泳，必要时也可使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。 𐟔젥—𖨍祅‰定量PCR（RT-qPCR）基本原理：在PCR体系中加入能够指示DNA片段扩增过程的荧光染料或荧光标记的特异性探针，通过对PCR过程中产生的荧光信号累积或荧光标记的特异性探针释放的荧光信号进行监测和记录，实时监测整个PCR进程，再结合软件对获得的荧光信号数据进行分析，计算待测样品中特定DNA片段的初始量。扩增过程：包括荧光背景信号阶段、荧光信号指数增加阶段和荧光信号平台期阶段。常见问题与注意事项：在进行RT-PCR实验时，需要注意实验条件的选择、引物的设计、RNA的质量控制以及实验操作的规范性等问题，以确保实验结果的准确性和可靠性。

猫咪白血病：你需要知道的一切 𐟐𑊧Œ륒꧙𝨡€病（Feline Leukemia Virus，FeLV）是一种由猫白血病病毒引起的传染病，会导致猫咪免疫系统受损，增加患恶性肿瘤和其他疾病的风险。以下是关于猫白血病的详细信息： 𐟔 症状体重下降、身体消瘦食欲不振、精神萎靡发热、贫血淋巴结肿大容易感染各种疾病，如呼吸道感染、胃肠道感染等可能出现皮肤病变、肿瘤眼睛炎症、口腔溃疡 𐟦 成因主要通过直接接触感染猫的唾液、鼻腔分泌物、粪便等传播，也可通过母婴传播。 𐟧꠨–튩…𖨁”免疫吸附试验（ELISA）检测病毒抗原聚合酶链反应（PCR）检测病毒核酸血常规检查，查看白细胞、红细胞、血小板等指标临床症状和身体检查，如检查淋巴结、腹部触诊等 𐟒Š 治疗支持治疗：包括补充营养、输液以纠正脱水和电解质紊乱、使用抗生素治疗继发感染等。对症治疗：针对具体症状进行治疗，如使用退烧药、止血药等。 𐟏 后期护理提供营养丰富、易消化的食物，保证猫咪的营养需求。定期带猫咪去兽医处复查，监测病情进展和治疗效果。减少猫咪的应激，提供安静、舒适的生活环境。避免猫咪与其他可能感染的猫接触。 ⚠️ 注意事项猫白血病目前尚无特效治愈方法，治疗的目的主要是缓解症状、延长猫咪的生存时间和提高生活质量。

「科学家的故事」【从DJ、种树人再到火星生命探索，新晋诺奖得主Gary Ruvkun教授的科学流浪者之旅】来源：@药明康德尽管Ruvkun因miRNA的重大发现赢得了无数奖项与荣誉，但他从未忘记过最初对天文学的好奇。除了在实验室工作外，Ruvkun还会在业余时间阅读天文学、地质学和行星科学的书籍，甚至曾启动一项“疯狂”的计划——利用聚合酶链反应（PCR）在火星上寻找生命。在哈佛火星项目中，Ruvkun与同事们设计了一种小型机器人PCR检测器，能够现场放大和测序任何存在于外星土壤中的DNA，希望借此检测火星土壤样本中的古代核糖体RNA基因序列，这些序列在地球上已知的所有生命形式中都是保守的。 Ruvkun在接受《科学》杂志的采访时曾表示，像他这样的遗传学家之所以在科学上保持年轻，是因为会不断接触到新领域。他说，他从来不知道下一个实验会把他带到哪里，但这没关系。事实证明，科学研究与流浪者的生活并没有太大区别，“这就像是跳上一辆公交车，看看它会开往哪里。” 阅读全文：网页链接「2024年诺贝尔奖」「2024年诺贝尔生理学或医学奖公布」

单基因携带者筛查的三大关键技术在分子生物学领域，单基因携带者的筛查至关重要，它涉及到一系列先进的检测技术。以下我们将详细介绍三种主要的方法：聚合酶链反应（PCR）𐟔슐CR 是一种强大的分子生物学技术，专门用于放大特定的 DNA 片段。通过设计针对特定基因的引物，可以在体外进行 DNA 扩增。实时荧光定量 PCR 是其衍生技术之一。 PCR 的应用非常广泛，例如，它可以用于检测囊性纤维化等单基因病的相关基因突变。通过分析扩增产物的大小和序列，可以确定是否存在突变。PCR 的灵敏度高、特异性强，操作相对简单，能够快速检测已知的特定突变。然而，它只能检测有限的突变位点，对于新的或未知突变可能无法检测。桑格测序（Sanger sequencing）𐟧슦ᑦ 𜦵‹序是一种经典的基因检测方法，通过在 DNA 合成反应中加入不同的双脱氧核苷酸，使合成反应在不同位置终止，从而产生不同长度的 DNA 片段。这些片段通过电泳分离后，可以读取序列。桑格测序的准确性高，是基因检测的“金标准”，能够检测已知和未知的突变。然而，它的成本相对较高，通量较低，不适合大规模筛查。在进行遗传性耳聋基因筛查时，桑格测序可以确定常见的耳聋相关基因是否存在致病突变。下一代测序（NGS）𐟌 NGS 技术包括全基因组测序（WGS）、全外显子组测序（WES）和目标区域测序等。NGS 技术能够同时对大量的 DNA 片段进行测序，产生海量的测序数据。在单基因携带者筛查中，WES 和目标区域测序较为常用。它们可以检测多个基因的多种突变类型，包括点突变、插入/缺失、拷贝数变异等。NGS 的高通量和广检测范围使其能够同时检测多个基因，但数据分析复杂，需要专业的生物信息学分析能力。成本相对较高，对于某些低频突变的检测灵敏度可能较低。基因芯片技术𐟒𛊥𞮩˜𕥈—芯片是一种将大量已知的 DNA 探针固定在芯片表面，与待测样本中的 DNA 进行杂交的技术。通过检测杂交信号的强度和模式，可以确定样本中是否存在特定的基因突变。微阵列芯片可用于单基因携带者筛查，例如检测地中海贫血、脆性 X 综合征等常见单基因病相关基因的突变。它可以同时检测多个基因的多个突变位点，通量较高，操作相对简单。然而，它只能检测已知的突变，对于新的或罕见突变可能无法检测。这些技术各自有其优势和局限性，在实际应用中，需要根据具体需求选择合适的方法。

转录组测序关键点𐟌𑊨𝬥𝕧𛄦𕋥𚏯𜌥쨵𗦝妜‰点高大上，但其实它是你研究基因表达模式的重要工具。就像做任何实验一样，转录组测序也有一些需要注意的地方。下面我就来聊聊这些关键点，希望能帮到你。样品准备阶段 𐟌𞊩€‰择合适的样品：首先，你得确保你选的样品和你研究的目的匹配。比如说，你要研究某个特定组织的表达模式，那就得选这个组织的样品。植物的生长状态、组织的特异性以及表达水平的差异都要考虑进去。避免污染和降解：样品要尽量避免外界环境的污染和降解，保持RNA的完整性。这个很重要，因为RNA一旦降解，测序结果就会大打折扣。遵循三个原则：代表性、一致性和迅速性。样品要有代表性，能反映整体情况；一致性是指样品之间要有可比性；迅速性则是为了保持RNA的活性。 RNA提取和质量检测：使用高纯度的RNA样品，确保提取出的RNA完整、无降解、无污染。先评估样品的RNA含量和质量，采用合适的方法进行提取，比如酚/氯仿法或基于硅胶柱的提取方法。文库构建与测序阶段 𐟔슥ˆ𖥤‡cDNA文库：选择合适的文库构建方法，比如常规的RNA聚合酶链反应（RT-PCR）或纳米球技术（Next-Generation Sequencing）。注意选择适合的文库构建方法和质量控制。序列测定：选择合适的高通量测序平台进行测序，比如Illumina HiSeq或PacBio。测序深度和策略要取决于你的研究目的和预算。数据分析与结果解读 𐟓Š 基本数据质量评估和过滤：对测序数据进行基本的质量评估和过滤，确保数据的准确性和可靠性。生物信息学分析：包括基因表达量定量、差异表达分析和通路分析等。解读转录组测序结果时，需要结合已有的文献和数据库，寻找与研究目的相关的基因和通路信息。验证：验证关键基因的差异表达，可以通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等方法。建议先尽量多做几个基因进行验证，比如20-40个基因，并注意选取的基因表达量不要过低。其他注意事项 𐟓‹ 生物学重复：生物学重复是生物实验所必须的，转录组测序也不例外。建议至少进行3次生物学重复。数据量与基因组大小：转录组测序所需数据量与所研究物种的基因组大小有关。基因组越大，所需数据量越大。常规物种一般建议6G数据即可；基因组较大的物种推荐8G以上数据，比如小麦建议10G数据起。运输与保存：组织样本在运输过程中应保持低温（4℃-16℃），避免直接置于液氮中以防止组织破裂。组织样本应储存在密封的容器中，并用棉花填充以防止震动造成的样本损坏。总之，遵循这些注意事项，可以确保你的转录组测序实验顺利进行和结果的准确性。希望这些建议对你有所帮助！

PCR常见问题及解决方法全解析 PCR（Polymerase Chain Reaction），即聚合酶链式反应，是生物领域中最基础且重要的一环。它通过变性、退火、延伸等步骤，在DNA聚合酶的催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。 PCR反应体系中包含几个关键成分：模板（Template）：可以是基因组、质粒DNA、cDNA，甚至是细菌或组织样品。引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性，并确定引物长度。 DNA聚合酶（DNA Polymerase）：推动PCR反应进行的“机器”。缓冲液（Buffer）：控制体系的pH和离子，为DNA聚合酶提供最佳工作环境。脱氧核苷酸（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，是DNA的基本组成元件。 Mg、K离子增强剂：增强PCR反应的效果。在实际操作过程中，PCR可能会遇到多种问题，如PCR产物条带拖尾、有杂带，甚至完全没有条带等。以下是一些常见问题及其原因：完全没有条带试剂质量问题或加样错误：导致反应体系不完整。模板DNA问题：模板与引物无法结合。引物或反应温度设计不合理：引物特异性差或退火温度不合适。有很多非特异性条带反应体系污染：反应体系被污染。引物特异性差：引物特异性差。退火温度不合适：退火温度不合适。目的条带弱聚合酶活性过低：聚合酶活性过低。循环次数偏低：循环次数偏低。模板DNA浓度过低：模板DNA浓度过低。 PCR产物出现片状拖尾 DNA聚合酶过多或酶活性差：DNA聚合酶过多或酶活性差。 dNTP和Mg离子浓度过高：dNTP和Mg离子浓度过高。退火温度过低或循环数偏多：退火温度过低或循环数偏多。模板DNA用量过大或模板不纯：模板DNA用量过大或模板不纯。引物特异性差或形成二聚体：引物特异性差或引物间形成二聚体导致非特异性扩增。了解了这些问题的原因后，就可以针对性地调整PCR条件，以获得理想的条带。希望这些信息能帮助大家在PCR实验中取得成功！

PCR检测主要是检测什么：一看便知道 𐟔ŽPCR，即聚合酶链反应，是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测DNA或RNA的存在和数量。PCR检测在多个领域有重要应用，主要包括以下几点： ✅病原体检测：PCR能够精准且迅速地识别病毒、细菌、真菌及寄生虫等病原体的核酸片段，从而明确患者是否感染及感染的具体类型。例如，在新冠病毒、乙肝病毒、人类免疫缺陷病毒等病毒的检测中，PCR技术发挥了重要作用。 ✅遗传病诊断：通过PCR检测相关基因的突变情况，如囊性纤维化、血友病、镰状细胞贫血、地中海贫血等遗传病，能够实现精准诊断。PCR技术能够敏锐地捕捉到基因中的微小变化，为遗传咨询、家庭生育规划以及早期干预治疗提供关键依据。 ✅肿瘤诊疗：在肿瘤领域，PCR检测可用于检测肿瘤细胞中的特定基因突变，如EGFR、KRAS等，这些基因突变的检测有助于选择合适的靶向药物进行治疗，并可用于监测肿瘤治疗效果、评估肿瘤复发风险等。 𐟔”该了解了检测方法以后，要了解适合哪些人群做检查，下面做的详细分析。 𐟔𙧖‘似感染患者：对于疑似感染某种病毒、细菌或寄生虫的患者，PCR检测能够迅速明确诊断，帮助医生制定治疗方案。 𐟔𙩁—传病筛查人群：有遗传病家族史或疑似遗传病症状的人群，通过PCR检测可以明确是否存在相关基因突变，从而进行早期干预和治疗。 𐟔𙨂🧘䦂㨀…：对于肿瘤患者，特别是需要进行靶向治疗的患者，PCR检测可以检测肿瘤相关基因的突变情况，为治疗方案的制定提供依据。为了提升检查结果的准确性，在检查期间需要做好护理工作，图片内容当中有介绍，大家有不懂或者想要咨询的问题，可以在评论区写下。𐟒Œ#领航计划#

HIV病毒载量正常范围你了解吗？速来围观 𐟔ŽHIV即人类免疫缺陷病毒，是一种能攻击人体免疫系统的病毒。HIV主要攻击人体免疫系统中的CD4+T淋巴细胞，使人体逐渐丧失免疫功能。如果有高危行为的情况下，可以到医院做HIV病毒载量的检查，确定是否在正常范围内，而HIV通常检测下限在20至40拷贝/毫升或更低水平。要注意！不同的检测方法和实验室可能会有略微不同的正常范围参考值。目前，大多数实验室检测的HIV病毒载量正常范围是检测不到病毒，即低于检测下限。如果检测结果显示病毒载量在正常范围内，即低于检测下限，通常可能表示患者经过有效的抗病毒治疗，病毒得到了很好的抑制。 𐟌Ÿ通过长期坚持规范的抗病毒治疗，患者体内的病毒复制可以被持续控制在极低水平甚至检测不到，这有助于恢复患者的免疫功能，降低机会性感染的风险，延长患者的生命并提高生活质量。如果出现这种情况，也可能是处于感染的早期，病毒载量还未上升到可检测的水平，但随着时间推移，病毒载量可能会逐渐升高。在极少数情况下，检测可能出现假阴性结果，需要结合其他检测方法如HIV抗体检测等进行综合判断。 ✅逆转录聚合酶链反应：这是一种常用的检测方法。首先从患者血液样本中提取RNA，然后通过逆转录将RNA转化为cDNA。接着利用PCR技术对特定的HIV基因片段进行扩增，通过检测扩增产物的量来确定病毒载量。该方法灵敏度高，能够检测到较低水平的病毒载量。 ✅核酸序列依赖性扩增技术：NASBA技术主要针对RNA进行扩增检测。在特定的反应体系中，利用逆转录酶、RNA聚合酶和核酸酶等酶的作用，对HIVRNA进行连续的扩增反应。该方法操作相对简单，不需要热循环，能够快速得到检测结果。 ✅分支DNA技术：bDNA技术是一种信号放大检测方法。首先将患者血液样本中的HIVRNA与固定在微孔板上的一系列寡核苷酸探针结合，然后通过添加多个标记有酶的分支DNA探针，与HIVRNA杂交形成复合物。最后通过检测酶的活性来确定病毒载量。该方法具有较高的准确性和重复性。生活当中也可以通过一些方法来预防HIV病毒感染，预防方法在图片上如果还有什么想要了解的问题，都可以在评论区留言。#领航计划#

急性淋巴细胞白血病为什么要进行特殊基因检查？目前要进行哪些基因检查？急性淋巴细胞白血病特殊基因检测能够使临床医生对疾病进行更为精确的分类，可用于化疗后微小残留病的监测以及精确的疗效判断，指导下一步治疗。常用的方法有聚合酶链反应（PCR）、基因特异探针的荧光原位杂交（FISH）等。目前进行的分子生物学检测有 BCR-ABL、MLL-AF4、E2A-PBX1、TEL-AML1、SIL- TAL1 融合基因以及 IgH、TCR 重排等。 #国庆健康记#

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