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非同源末端连接在线播放_同源重组的简单过程(2024年11月免费观看)

内容来源：冲顶技术团队所属栏目：导读更新日期：2024-11-29

非同源末端连接

三种新型碱基编辑技术：CRISPR的突破在CRISPR技术的研究中，科学家们发现了一个有趣的现象：与非同源末端连接（NHEJ）相比，同源重组修复（HDR）的发生频率相对较低，尤其是在非分裂的细胞中，这一差异尤为明显。面对这一挑战，科学家们并没有止步于提高HDR效率的尝试，而是开辟了新的研究路径，成功研发了三种创新的碱基编辑技术：胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）、腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）和先导编辑器（PE）。这些技术的出现，为基因编辑领域带来了新的可能性和希望。

𐟧샒ISPR-Cas9技术大揭秘𐟔 𐟤”你是否对CRISPR-Cas9技术感到好奇？让我们一起来探索它的神奇之处吧！𐟚€ 𐟌𑃒ISPR-Cas9系统，一个基于分子事件的精密工具，从CRISPR序列适应外源DNA开始，通过一系列转录和加工，最终形成成熟的CRISPR RNA或单导RNA。𐟒犊𐟔—接着，这些RNA与Cas9蛋白结合，形成强大的复合物。这个复合物能够通过RNA的spacer序列，高度精准地引导Cas9蛋白结合到目标DNA上。𐟎𐟒夸€旦结合，Cas9蛋白会触发其内切酶活性，导致目标DNA的双链断裂。这是细胞修复机制启动的信号，包括非同源末端连接和同源重组，从而实现基因组的精准编辑。𐟛 ️ 𐟒ᨿ™一技术为疾病治疗和基因研究提供了前所未有的工具，展现了基因编辑的巨大潜力。现在，你是否对CRISPR-Cas9技术有了更深入的了解呢？✨

CRISPR/Cas9攻略，科研必备！听说大年三十还在刷科研帖的朋友，来年实验都会顺利哦！𐟎‰ 一、实验原理基因敲除：CRISPR/Cas9系统通过Cas9酶切割靶基因组，形成DNA双链断裂。通常情况下，细胞会通过非同源末端连接（NHEJ）方式修复断裂的DNA，修复过程中可能发生碱基插入或缺失，导致移码突变，从而使靶标基因失去功能，实现基因敲除。基因敲入：CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，进行切割。sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列，形成RNA-DNA杂交，激活Cas9酶。Cas9酶作为DNA剪切酶，相对准确地切割目标DNA序列，donor DNA通过同源重组（HDR）将外源基因整合到切割位点，实现对基因组的编辑。二、实验步骤设计sgRNA：根据实验需求设计合适的sgRNA序列。合成sgRNA：将设计好的sgRNA序列进行合成。表达Cas9和sgRNA：将Cas9和sgRNA进行表达，通常通过载体进行。切割目标基因：利用Cas9酶切割目标基因序列。筛选单克隆：通过筛选获得含有编辑基因的单克隆细胞。基因编辑结果验证：对基因编辑结果进行验证，确认编辑成功。通过以上步骤，你可以实现对基因组的精准编辑，为科研实验提供有力支持。𐟔찟’က

crispr-cas9技术原理 𐟓– CRISPR-Cas9，这一原核生物中的适应性免疫系统，如今已成为基因编辑的利器。它属于2类CRISPR-Cas系统，主要依赖单蛋白效应物Cas9来发挥作用。 𐟒ᠥœ訿™个系统中，Cas9蛋白与sgRNA（单链引导RNA）结合，形成复合物。这个复合物能够识别并切割基因组上的特定序列，从而实现基因编辑的目的。 𐟔ꠃas9蛋白的切割作用会形成双链断裂（DSB），随后细胞会启动DNA修复机制。其中，非同源末端连接（NHEJ）是一种常见的修复方式，它可能导致插入或敲除基因片段，但也可能引发移码突变。 𐟛 ️ 除了NHEJ，还有可变非同源末端连接（MMEJ）和同源定向修复（HDR）等修复方式。这些方式在基因编辑过程中发挥着重要作用，可以根据需要进行选择和调整。 𐟌Ÿ CRISPR-Cas9技术的原理和应用非常复杂，但通过深入了解，我们可以更好地掌握这一技术的精髓，为基因编辑领域的研究和应用提供有力支持！

CRISPR/Cas9基因编辑全流程详解你知道CRISPR/Cas9技术吗？这是一种强大的基因编辑工具，能够在特定DNA位点进行精准编辑。今天，我们来详细讲解CRISPR/Cas9的原理和操作步骤，帮助你更好地理解这项技术。 𐟔 原理 CRISPR/Cas9技术的核心是CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列）和Cas9（CRISPR相关蛋白9）两种成分。CRISPR是一段特殊的DNA序列，用于记录病毒入侵的历史，并通过间隔序列存储病毒的DNA片段。Cas9则是一种核酸酶，能够在特定DNA序列上切割双链DNA。在基因编辑过程中，研究人员首先设计一条与目标DNA序列互补的单链RNA引导分子（sgRNA）。这条sgRNA能够携带Cas9蛋白，通过碱基互补配对的方式精确找到目标DNA序列。一旦定位成功，Cas9蛋白就会在sgRNA的引导下切割目标DNA双链，产生DNA双链断裂（DSB）。细胞在修复这些DSB时，可以通过两种主要机制进行：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。在没有同源模板的情况下，NHEJ机制会被激活，导致目标基因被删除或产生插入/缺失突变，从而实现基因的敲除。而HDR机制则允许在DSB处外源DNA模板，实现精确的基因插入或替换。 𐟛 ️ 操作步骤设计sgRNA 选择目标基因中的合适靶点序列。使用专门的软件（如CRISPRDesign Tool）设计sgRNA序列，确保其具有高度的特异性和准确性。制备sgRNA 通过体外转录技术或化学合成方法制备sgRNA。验证sgRNA的纯度和完整性，通常使用凝胶电泳等技术进行。构建CRISPR/Cas9系统将Cas9编码序列和sgRNA序列克隆到适当的载体中，如质粒或病毒载体。确保CRISPR/Cas9系统能够在细胞中稳定表达。转染细胞使用基因转染、电穿孔或病毒介导转导等方法将CRISPR/Cas9系统导入目标细胞。根据细胞类型和转染效率选择合适的转染方法。筛选和鉴定基因编辑细胞使用特定的筛选标记（如荧光蛋白或抗生素抗性基因）富集成功转染的细胞。通过分子生物学方法（如PCR和测序）验证目标基因的编辑情况。筛选出具有目标基因敲除、插入或替换的细胞克隆。功能验证研究编辑后细胞的表型变化和功能影响，如细胞增殖、分化、迁移等。使用流式细胞术、Western Blotting（WB)或免疫组化等技术检测目标蛋白的表达情况。 CRISPR/Cas9技术通过精确识别和切割目标DNA序列，结合细胞自身的修复机制，实现了对基因的敲除、插入或替换。其操作方法包括设计sgRNA、制备CRISPR/Cas9系统、转染细胞、筛选和鉴定基因编辑细胞以及功能验证等步骤。这一技术为基因编辑领域带来了巨大的变化，并在微生物工程等领域展现出广阔的应用前景。

CRISPR-Cas9基因编辑全解析今天，我想和大家聊聊一个超级酷的技术——CRISPR-Cas9基因编辑系统。准备好了吗？Let's go！ 𐟌Ÿ CRISPR-Cas9系统的核心组件首先，让我们来了解一下CRISPR-Cas9系统的核心组成部分。最常用的Cas9蛋白来自一种叫sp的细菌。这个蛋白就像一把分子剪刀，可以在基因组的特定位置切断DNA双链。接下来是sgRNA，也就是引导RNA。它是由两部分组成的： 𐟓 crRNA：大约20个碱基长，与目标DNA序列精确互补，决定了Cas9的切割位置。 𐟓 tracrRNA：与Cas9蛋白结合，确保sgRNA与Cas9形成稳定复合物。最后，还有一个PAM序列，这是Cas9切割的必要条件。Sp的Cas9识别的PAM是5'-NGG-3'（N表示任意碱基）。目标DNA中必须在靶序列下游存在PAM序列，否则Cas9无法切割。 𐟌Ÿ CRISPR-Cas9基因编辑的步骤选择编辑位点 𐟎斥…ˆ，你需要选择一个基因组中需要修改的区域，并设计与该区域互补的sgRNA靶序列。然后确定PAM序列的位置，选择的靶序列必须靠近PAM序列，以确保Cas9能在正确位置切割。形成sgRNA与Cas9复合物 𐟧슳gRNA可以在体外合成或在细胞内表达。sgRNA和Cas9蛋白结合形成复合物，并准备寻找靶标DNA。识别与结合DNA 𐟔 sgRNA与基因组中的目标序列互补配对（通常是20个碱基的长度）。Cas9蛋白会扫描DNA，寻找与sgRNA互补的序列。当找到靶序列并确认其附近有PAM时，Cas9会与该区域结合。切割DNA双链 ✂️ 当Cas9与靶DNA结合后，Cas9的两个切割活性位点（HNH和RuvC结构域）会分别切断DNA双链。HNH结构域切割与sgRNA互补的DNA链，而RuvC结构域则切割另一条非互补链。结果是DNA双链被切断，产生一个双链断裂（DSB）。修复DNA断裂 𐟛 ️ 细胞有两种方式来修复DNA断裂：非同源末端连接（NHEJ）：这是细胞对DNA断裂的快速修复途径，直接将断裂的DNA片段连接在一起。修复过程中常会引入小的插入或缺失，导致基因突变或失活（即敲除基因）。同源重组（HDR）：如果科学家在细胞中加入一个供体DNA模板，细胞可以利用模板进行精确修复。这使特定的碱基可以被替换或插入，达到精确编辑的目的（即敲入基因）。希望这篇文章能让你对CRISPR-Cas9基因编辑技术有一个清晰的认识！如果你有任何问题或想了解更多，欢迎在评论区留言哦！

CRISPR文库筛选：从基础到实践 (一) CRISPR-Cas9系统：基因编辑的“手术刀” 𐟔ꊃRISPR-Cas9系统是一种强大的基因编辑工具，由Cas9蛋白和单个sgRNA组成，专门针对一个基因进行编辑。这个系统依赖于基因组上的PAM序列（NGG），它的存在可以防止CRISPR-Cas切割细菌本身的CRISPR序列，但也限制了编辑范围。 PAM序列的重要性 𐟌 PAM序列是CRISPR-Cas9系统识别和切割位点的关键。改变Cas识别的PAM序列可以扩大编辑范围，这在基因编辑领域是一个热门研究方向。然而，缩短PAM序列也会增加脱靶风险，同时可能降低编辑活性。 Cas9蛋白的大小 𐟓 Cas9蛋白的大小是基因治疗中的一个重要考虑因素。AAV（腺相关病毒）是基因递送的主要载体，具有器官靶向性和低免疫原性。然而，AAV的包装容量有限，无法容纳常用的SpCas9系统（含有1368个氨基酸）。因此，开发更小的Cas9系统成为了一个研究热点。2015年，张锋课题组开发出了SaCas9系统，可以用单个AAV包装递送，成为体内基因治疗的最常用工具。筛选高活性的Cas9和sgRNA 𐟔슧훩€‰高活性的Cas9和sgRNA是提高基因编辑效率的关键。通过正向遗传学方法，科学家们从随机突变中寻找表型/功能的变化，然后探索引起这些变化的基因突变。而反向遗传学方法则是通过评估某些基因的重要性，利用基因编辑技术改变这些基因，然后观察可能出现的表型变化。 NHEJ与HDR：两种修复机制 𐟛 ️ 在基因编辑过程中，了解NHEJ（非同源末端连接）和HDR（同源定向修复）两种修复机制非常重要。NHEJ修复途径是最活跃的修复机制，能够快速修复双链断裂，但通常会在双链断裂位点产生小的插入或缺失。而HDR则是一种精准修复机制，可以借助外源引入的短单链DNA序列或质粒为模板，实现精准基因插入。文库筛选：从细胞模型到表型读取 𐟓Š 文库筛选是CRISPR研究中的重要步骤。研究人员通常使用肿瘤细胞、原代细胞或类器官作为细胞模型。类器官模型的一个主要挑战是转染问题，因为类器官细胞是聚团的，且含有多种类型的细胞。在选择CRISPR方式时，需要权衡Knockout、interference和activation三种方法。筛选过程也是富集的过程，需要研究不同表型的表现。最后，针对所研究的表型选择正确的方式来读取结果，比如流式、高通量测序等。通过这些方法和技术，CRISPR文库筛选为科学家们提供了强大的工具来探索和理解基因的功能和相互作用。

CRISPR/Cas9攻略，科研必备！听说大年三十还在刷科研帖的朋友，来年实验都会顺利哦！一、实验步骤设计sgRNA 𐟓 首先，你需要设计出能够精准识别目标基因的sgRNA。这个过程需要一定的生物信息学知识，确保你的sgRNA能够有效地与目标序列结合。合成sgRNA 𐟧슨彤𙋥Ž，接下来就是合成sgRNA。这一步通常需要专业的生物技术公司来完成，确保合成的准确性。表达Cas9和sgRNA 𐟒‰ 将设计好的sgRNA与Cas9蛋白一起表达，这是基因编辑的关键步骤。你需要构建一个能够同时表达Cas9和sgRNA的载体，并将其导入到细胞中。切割目标基因 ✂️ 一旦Cas9和sgRNA进入细胞，它们就会识别并切割目标基因。这个过程是基因编辑的核心，切割的准确性直接影响到后续的实验结果。筛选单克隆 𐟔 切割完成后，你需要筛选出那些被成功编辑的细胞。这一步通常通过PCR或其他分子生物学技术来完成，确保你得到的是编辑成功的单克隆。基因编辑结果验证 ✅ 最后，你需要验证基因编辑的结果。这可以通过测序或其他分子生物学方法来完成，确保你的基因编辑是准确无误的。二、实验原理基因敲入 𐟔犥œ胒ISPR/Cas9系统中，sgRNA识别并结合目标基因的靶向序列，形成RNA-DNA杂交。Cas9酶作为一种DNA剪切酶，可以相对准确地切割目标DNA序列。随后，donor DNA通过同源重组（HDR）的方式将外源基因整合到这个切割位点上，实现对基因组的编辑。基因敲除 ✖️ Cas9可以对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂。通常情况下，细胞会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）对断裂的DNA进行修复。在修复过程中通常会发生碱基插入或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能，从而实现基因敲除。希望这篇指南能帮助你更好地理解CRISPR/Cas9基因编辑技术，祝你实验顺利！

质粒克隆：无缝克隆与T4法的关键区别在分子生物学中，质粒克隆是构建基因工程载体的重要步骤。𐟔찟笠无缝克隆法和T4法是两种常见的质粒克隆技术，它们各有千秋，适用于不同的实验需求。无缝克隆法，也称为同源重组法，利用同源重组酶来实现质粒与目的片段的连接。𐟔„ 这种方法的原理在于，线性化载体与目的片段通过20bp左右的同源臂进行互补配对，然后利用DNA聚合酶补齐碱基，最后通过DNA连接酶连接上两个切口。无缝克隆法的关键在于其产生的超长3’突出末端，这20bp的同源臂可以视为一个长黏性末端进行互补配对。相比之下，T4法使用相同的限制性内切酶双酶切载体和目的片段，产生相同的黏性末端，然后使用T4连接酶进行连接。𐟔— T4法产生的黏性末端一般仅有2-4bp，这使得它在连接小片段时更为高效。无缝克隆法和T4法的主要区别体现在以下几个方面：连接目的片段的能力：无缝克隆法的20bp同源臂能够固定更长的目的片段进行连接，适合连接超过1000bp的目的片段。而T4法更适合连接短片段，通常不超过2000bp。容错率：无缝克隆法的超长末端虽然提高了连接的稳定性，但也增加了非正常配对的可能性。当同源臂或其两侧出现可以自身互相碱基配对的序列时，连接反应可能会受阻。这种情况虽然是小概率事件，但偶尔会导致连接失败。T4法则由于黏性末端较短，难以发生错误的配对。操作简便性：T4法操作相对简单，适合初学者。无缝克隆法则需要一定的实验技巧和经验，以确保实验的成功。在选择无缝克隆法还是T4法时，应根据实验目的和条件来决定。对于需要连接长片段或对容错率有严格要求的研究，无缝克隆法可能更为合适。而对于短片段的连接或需要快速得到结果的实验，T4法则是一个更便捷的选择。𐟏…𐟔쀀

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