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DNase前沿信息_dnase和rnase区别(2024年11月实时热点)

内容来源：冲顶技术团队所属栏目：教程更新日期：2024-11-27

DNase

𐟒焅PC水用途及注意事项 𐟧你知道DEPC水是什么吗？它可是经过DEPC处理并高温高压消毒的Milio纯水哦！𐟒把𐟔DEPC水99.99%以上都是水，而且不含RNase、DNase，超级纯净！𐟒ꊊ𐟒‰这种水可以用于RNA沉淀的溶解，还有各种需要无RNase、DNase和proteinase的反应体系，比如反转录、siRNA的退火等。𐟧슊⚠️但是要注意哦，DEPC是一种潜在的致癌物，所以DEPC水是有毒的，千万不要喝！如果沾到皮肤上，记得立刻冲洗。𐟚🊊𐟓š实验室用水其实有很多种，根据GB/T6682-2008标准，主要分为三个等级：一级、二级和三级。一级水质量最好，适用于最高精度的分析实验；二级水次之；三级水质量最次，主要用于清洗或溶液稀释等一般的化学分析试验。𐟔슊𐟒ᦉ€以呀，在使用水的时候，要根据需要来选择哦！如果只是清洗用，三级水就足够了，无需使用更高级的水，这样也能节省不少成本呢！𐟒𐀀

手把手教你感受态细胞的制备与转化 𐟧늣## 感受态细胞的概念首先，咱们得搞清楚什么是感受态细胞。简单来说，感受态细胞就是那些特别容易接受外源DNA片段的细胞。它们就像一群爱学习的小学生，只要你有好故事（外源DNA），它们就会迫不及待地吸收进去。要制备感受态细胞，通常需要用到一些化学试剂，比如CaCl2或者RuCl3。这些试剂能让细胞膜的通透性变大，就像是给细胞打开了一扇门，让外源DNA更容易进入。基本要求感受态细胞有几个基本要求：没有质粒：或者有与待转质粒兼容的质粒。容易被转进去：一般是G-细菌，细胞壁薄。营养条件一般：不是那种特别娇气的细菌。转化原理在基因克隆技术中，转化就是把质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，让它获得新的遗传特性。这个过程就像是给细菌换了个新衣服，让它变得更强大。感受态细胞的制备方法有很多，比如电击法、化学试剂法等等。今天咱们主要聊聊化学制备法，特别是CaCl2法。这个方法最早是由Cohen在1972年发现的，简单、快速、稳定，还被广泛用于外源基因的转化。化学制备法 CaCl2法的原理其实很简单。首先，把大肠杆菌放在0℃的CaCl2低渗溶液中，让细胞膨胀成球形。然后，把DNA和CaCl2混合，形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物，这个复合物会粘附在细胞表面。接着，用42℃的热冲击处理一下，细胞就会吸收这个复合物。最后，把细胞放在丰富培养基上生长数小时，球状细胞会复原并分裂增殖。这样，被转化的细菌中，重组子的基因就会得到表达，你可以在选择性培养基平板上选出你需要的转化子。小贴士用CaCl2处理的感受态细胞，转化率一般能达到5㗱06~2㗱07转化子/ug质粒DNA，完全能满足一般的基因克隆实验。如果你想要更高的转化率，可以试试联合其他的二价金属离子（比如Mn2+、Co2+）、DMSO或者还原剂等物质处理细菌。总结化学法制备感受态细胞虽然简单，但非常实用。它不仅稳定、重复性好，而且菌株适用范围广。制备好的感受态细菌可以在-70℃保存，非常方便。所以，如果你在做基因克隆实验，不妨试试这个方法！𐟧슊希望这篇指南能帮到你，祝你实验顺利！𐟚€

质粒抽提的溶液及其作用详解 𐟌 在进行质粒抽提时，我们通常会用到几种关键的溶液，每种溶液都有其独特的作用。让我们一起来看看这些溶液的成分和它们在质粒抽提过程中的重要性吧！溶液 P1 𐟌🊦ˆ分：Tris-HCl、EDTA、葡萄糖作用：Tris-HCl 作为缓冲溶液，确保反应体系的 pH 保持恒定。EDTA 是一种金属离子螯合剂，能够与微生物体内的金属离子结合，从而抑制 DNase 的活性，减少 DNA 被降解的风险。葡萄糖则增加溶液的粘度，有助于菌体沉淀的悬浮，延缓菌体沉降的时间。溶液 P2 𐟒劦ˆ分：氢氧化钠和 SDS 作用：主要用于细胞裂解。氢氧化钠是关键成分，它能破坏细胞膜的结构，使其从双层膜结构转变为微囊结构，从而导致细胞裂解。SDS 则起到辅助作用，它是一种阴离子去垢剂，能溶解细胞膜上的脂肪与蛋白，进一步破坏细胞膜；解聚细胞中的核蛋白，使蛋白质与 DNA 分开；还能与蛋白质结合形成 SDS-蛋白质复合物，导致蛋白质变性沉淀；此外，SDS 能抑制核酸酶的作用，防止 DNA 降解。溶液 N3 𐟌€ 成分：醋酸钾和醋酸作用：用于中和第二步中加入的强碱，避免强碱长时间与 DNA 接触而破坏其结构；同时可清除细胞内的杂质，如蛋白质等。加入溶液 N3 后会产生大量沉淀，这是因为醋酸钾与溶液 P2 中的 SDS 相互作用，生成了不溶于水的十二烷基硫酸钾（PDS）。SDS 容易与蛋白质结合，平均每两个氨基酸会结合一个 SDS 分子形成 SDS2 多肽复合体，使变性蛋白质溶解在溶液中并与基因组 DNA 缠绕。加入溶液 N3 后，十二烷基硫酸盐与变性蛋白质结合成复合体，PDS 的沉淀将变性的蛋白质一并沉淀，同时也共沉淀了大部分与变性蛋白质缠绕的基因组 DNA。溶液 PE（wash buffer）𐟒犦ˆ分：Tris-HCl和乙醇作用：主要用于清洗掉多余的盐离子。DNA 与硅胶柱吸附后，需用 Wash buffer 洗去多余的盐离子。由于乙醇会影响后续的酶切或测序反应，所以在洗脱 DNA 前必须在离心机内“空甩”柱子，以完全清除乙醇。溶液 EB（Elution buffer）𐟌€ 成分：Tris-HCl 作用：用于洗脱硅胶柱上的 DNA 样品。洗脱缓冲液中不能含有过高浓度的盐离子，因为盐阳离子会打破硅胶负氧根和水之间的氢键，使硅胶整体携带正电，从而吸引带负电的 DNA 分子。通过这些溶液的巧妙组合和使用，我们能够有效地从细胞中提取出质粒 DNA，为后续的实验研究提供纯净的 DNA 样品。

细胞培养常见问题及解决方法汇总细胞培养是许多生物实验和研究的基石，但操作过程中难免会遇到各种问题。以下是常见的一些细胞培养问题及其解决方法：培养液出现沉淀，但pH值不变 𐟌᯸ 可能原因：洗涤剂清洗后残留磷酸盐、玻璃器皿未彻底清洗、培养液未完全溶解。解决方法：用去离子水反复冲洗玻璃器皿并除菌，将培养液加热到37℃并摇动使其溶解，如沉淀仍存在则丢弃培养液。培养液出现沉淀，同时pH值变化 𐟌᯸ 可能原因：细菌或真菌污染。解决方法：丢弃培养物，或用抗生素除菌。培养细胞不贴壁 𐟌𑊥糖𝥎Ÿ因：胰蛋白酶消化过度、支原体污染、培养液中无贴壁因子。解决方法：缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。悬浮细胞成簇 𐟌€ 可能原因：培养液中含钙、镁离子、支原体污染、蛋白酶过度消化。解决方法：用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，分离培养物并检测支原体，如发现支原体污染则丢弃培养物，用DNase1处理细胞。培养细胞死亡 𐟒€ 可能原因：培养箱内无CO2、温度波动太大、细胞冻存或复苏过程中损伤、培养液渗透压不正确、培养液中有毒代谢产物堆积。解决方法：检测培养箱内CO2和温度，取新的保存细胞种，检测培养液渗透压，加入额外试剂如HEPES或药物，换入新鲜培养液。培养细胞生长减慢 𐟌𑊥糖𝥎Ÿ因：更换不同培养液或血清、培养液中细胞生长必需成分耗尽、培养物中有少量细菌或真菌污染、试剂保存不当、细胞起始浓度太低、细胞老化、支原体污染。解决方法：比较新培养液与原培养液成分，增加起始培养细胞浓度，让细胞逐渐适应新培养液，换入新鲜配制培养液，补加谷氨酰胺或生长因子。细胞培养过程中遇到的问题多种多样，通过以上方法可以解决大部分常见问题，确保实验顺利进行。

𐟧ꠦŽ⧴℅PC水的奥秘 𐟔 DEPC水，你了解多少？这种经过特殊处理的水，在实验室中可是个“大明星”！ 𐟒砄EPC水是由DEPC（焦碳酸二乙酯）处理并经过高温高压灭菌的超纯水，它可是实验室中的“贵族”哦！这种水对核酸酶有着积极的抑制作用，让你的实验结果更加准确。 𐟓– 在生物实验中，DEPC水是不可或缺的。它可以用于RNA沉淀的溶解，以及各种需要无RNase、DNase和proteinase的反应体系。比如反转录、siRNA的退火等，让你的实验更加精准、高效！ 𐟒ᠥ€𜥾—一提的是，0.1%的DEPC就足以抑制大多数RNase，而且对实验反应的影响也是最低的。但是要注意哦，DEPC水不能加入含Tris的反应体系。 ✨ 现在，你是不是对DEPC水有了更深入的了解呢？在实验室中，选择合适的“水”可是个大学问哦！快来探索更多实验室小秘籍吧！

反转录：从RNA到cDNA的奇妙旅程 𐟌€ 反转录，听起来有点科幻，但其实它就在我们身边。简单来说，反转录就是用RNA作为模板，通过一种叫反转录酶的东西，合成出cDNA的过程。PCR（聚合酶链式反应）需要的东西，反转录也差不多需要：模板、引物、聚合酶、dNTP原料、Mg2+、缓冲液等等。不过，反转录不像PCR那样能指数级扩增，它只是默默地合成cDNA。引物：小分子大作用 𐟧슥𜕧‰饈†为两种：Oligo dT和Random引物。Oligo dT引物专门和真核生物mRNA的3' Poly A尾配对，能得到最高产量的全长cDNA。而Random引物则是由六个随机碱基组成，可以结合任何RNA。当你要鉴定非polyA RNA（比如tRNA、rRNA），或者目标区域有复杂二级结构或高GC含量，或者模板是原核生物来源时，就用Random引物吧。反转录酶：不同的温度和效率 𐟌᯸ 反转录酶可是个关键角色，不同的酶反应温度和效率都不一样。选择合适的酶能让你的实验事半功倍。原料：dNTP 𐟒‰ dNTP（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）是反转录的原料，和PCR中一样重要。dNTP的浓度要适中，过高会增加错误掺入率，降低反应特异性；过低则会影响反应速度。 MgCl2：酶的激活剂 𐟌🊍gCl2能提高酶活性，促进核酸骨架的形成，是反转录过程中不可或缺的一环。步骤及原理 𐟛 ️ 变性：先让RNA样品变性，65℃加热5分钟，或者70℃加热2分钟，然后迅速置于冰水浴中骤冷，并在冰上静置2分钟。变性是为了打开RNA的二级结构，提高第一链cDNA的产量。加入体系：不同试剂盒会把各种组分组合好，方便添加。模板RNA一般需要1-2微克，大多数试剂盒也能做到微量操作。去除DNA：有些试剂盒会加入DNA去除试剂（DNase I或双链特异性Dnase），建议最好去除，避免扩增基因组DNA。退火：如果用Random引物，需要在25℃退火5-10分钟，和PCR退火是一个原理，方便引物结合模板。Oligo dT引物长，可以在反转录温度时直接退火，所以不需要此步骤。延伸：不同酶的延伸时间和温度不同。如果模板GC含量高等复杂，可以适当提高温度。酶失活：不同酶的失活温度和时间也不同。注意事项 ⚠️ 产物可以立即用于PCR反应，或者短期在4℃保存，或者在-20℃保存少于半年。长期存放建议分装后在-80℃保存。cDNA应避免反复冻融。反转录虽然听起来有点高大上，但其实只要掌握了基本原理和操作步骤，你也可以轻松搞定。希望这篇指南能帮到你，祝你实验顺利！𐟚€

细胞生物学期末复习重点整理𐟓š 𐟓Œ 细胞生物学笔记 𐟓Œ 细胞生物学复习 𐟓Œ 细胞生物学丁明孝 𐟓š 十二五”普通高等教育本科国家级规划教材《细胞生物学》（第5版）主编：丁明孝、王喜忠、张传茂、陈建国 𐟔 复习重点整理：叶绿体的主要功能：光合作用的全过程光合作用的过程分为三大步骤：原初反应：光合色素分子从被光激发至引起第一个光化学反应为止，包括光能的吸收、传递、转换。电子传递与光合磷酸化：电子在电子传递体之间的传递和光合磷酸化，形成ATP和NADPH，即将电能转化为活跃的化学能。碳同化：将光反应所产生的ATP和NADPH中的活跃化学能转换为储存在糖类中稳定的化学能的过程。 MPF在细胞周期调控中的作用发现：细胞融合与PCC实验结论，爪蟾卵子成熟过程。结构组成：MPF是一种使多种底物蛋白磷酸化的蛋白激酶，由M期Cyclin-CDK形成的复合物。活化：随Cyclin浓度变化而变化，激酶与磷酸酶的调节，活化的MPF可使更多的MPF活化。功能：启动细胞从G2期进入M期的相关事件，包括核膜的破裂、染色质的凝集、有丝分裂纺锤体的形成、诱导靶蛋白的降解。胞外信号分子诱导的caspase依赖性细胞调亡的分子机制当细胞接受凋亡信号分子（Fas，TNF等）后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白结合，这些衔接蛋白又募集procaspase聚集在受体部位，procaspase相互活化并产生级联反应使细胞凋亡。下游caspase活化后作用于靶细胞：作用于底物，裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放并活化，降解DNA形成DNA ladder；裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂PS重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。 𐟓– 通过这些复习重点，希望能够帮助你更好地掌握细胞生物学的关键知识！

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